Το σύστημα ανίχνευσης RNA ελέγχει την έκφραση πρωτεΐνης σε συγκεκριμένα κύτταρα

Ερευνητές στο Broad Institute of MIT και Harvard και το McGovern Institute for Brain Research στο MIT έχουν αναπτύξει ένα σύστημα που μπορεί να αναγνωρίσει μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA σε ζωντανά κύτταρα και να παράγει την επιθυμητή πρωτεΐνη σε απόκριση. Χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνολογία, γνωστή ως επαναπρογραμματιζόμενοι αισθητήρες ADAR (RADARS), η ομάδα έδειξε πώς μπορούσαν να αναγνωρίσουν συγκεκριμένους τύπους κυττάρων, να αναγνωρίσουν και να μετρήσουν αλλαγές στην έκφραση μεμονωμένων γονιδίων, να παρακολουθήσουν καταστάσεις μεταγραφής και να ελέγξουν την παραγωγή πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από συνθετικό mRNA.

Η πλατφόρμα επέτρεψε ακόμη στην ομάδα να στοχεύσει και να σκοτώσει έναν συγκεκριμένο τύπο κυττάρου, γεγονός που υποδεικνύει μια πιθανή μελλοντική χρήση του ραντάρ για να βοηθήσει στην αναγνώριση και επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων ή στην εκτέλεση ειδικής κυτταρικής επεξεργασίας γονιδιώματος.

«Μία από τις γονιδιωματικές επαναστάσεις ήταν η ικανότητα προσδιορισμού της αλληλουχίας των μεταγραφωμάτων των κυττάρων», δήλωσε ο Fei Chen, Ph.D., μέλος του Central Institute στο Broad, ο Merkin Flow, επίκουρος καθηγητής στο Πανεπιστήμιο του Χάρβαρντ και συνεργάτης. -συγγραφέας των ερευνητών. Η μελέτη, που δημοσιεύτηκε στο Βιοτεχνολογία της φύσης. Μας επιτρέπει πραγματικά να μάθουμε για τους τύπους και τις καταστάσεις κυττάρων. Αλλά, συχνά, δεν μπορέσαμε να χειριστούμε συγκεκριμένα αυτά τα κύτταρα. Το ραντάρ είναι ένα μεγάλο βήμα προς αυτή την κατεύθυνση».

Ο Chen και οι συνεργάτες του περιγράφουν την τεχνολογία ραντάρ τους σε μια εργασία με τίτλο “Programmable Eukaryotic Protein Synthesis with RNA Sensors Using ADARs”, καταλήγοντας: “Συνολικά, τα ραντάρ αποτελούν τη βάση μιας επαναπρογραμματιζόμενης πλατφόρμας βιολογικών αισθητήρων. Έχει πολλές εφαρμογές για βιοϊατρική και διαγνωστική έρευνα. και θεραπεία». Επικεφαλής της ερευνητικής ομάδας ήταν οι πρώτοι συγγραφείς Jeremy Cobb, Ph.D., Shi Chen, Ph.D., και Yifan Zhang, Ph.D., και Ruhan Krajski, Ph.D., και Kai Jiang, Ph.D. , MIT.

Στην εργασία τους, οι συγγραφείς σημειώνουν ότι οι προγραμματιζόμενες προσεγγίσεις για την ανίχνευση και την απόκριση στην παρουσία συγκεκριμένων RNA σε βιολογικά συστήματα θα έχουν ευρείες εφαρμογές στην έρευνα, τη διάγνωση και τη θεραπεία. Για τη βασική έρευνα, η προγραμματιζόμενη στόχευση κυτταρικής κατάστασης της έκφρασης διαγονιδίων επιτρέπει την παρακολούθηση και τη διαταραχή συγκεκριμένων κυτταρικών καταστάσεων για την κατανόηση της λειτουργίας τους. Από μεταφραστική άποψη, η ανίχνευση και η στόχευση της κυτταρικής κατάστασης μπορεί να είναι κρίσιμης σημασίας για κυτταρικές και γονιδιακές θεραπείες και ελάχιστα επεμβατικές διαγνωστικές. Όμως, όπως σημείωσε ο Omar Abudayeh, PhD, συνεργάτης του McGovern και συν-συγγραφέας της μελέτης, «Αυτή τη στιγμή, τα εργαλεία που έχουμε για τη χρήση δεικτών κυττάρων είναι δύσκολο να αναπτυχθούν και να κατασκευαστούν. «Θέλαμε πραγματικά να αναπτύξουμε έναν προγραμματιζόμενο τρόπο για την αίσθηση και την απόκριση στην κυτταρική κατάσταση».

Ο Δρ Jonathan Gutenberg, επίσης συνεργάτης στο Ινστιτούτο McGovern και συν-συγγραφέας, πρόσθεσε ότι η ομάδα προσπάθησε να δημιουργήσει ένα εργαλείο που θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει όλα τα δεδομένα που παρέχονται από την αλληλουχία RNA μονοκυττάρου, η οποία έχει αποκαλύψει μια τεράστια συστοιχία. “Τύποι κυττάρων και καταστάσεις κυττάρων στο σώμα. Θέλαμε να ρωτήσουμε πώς μπορούμε να χειριστούμε τις κυτταρικές ταυτότητες με τρόπο τόσο εύκολο όσο η επεξεργασία γονιδιώματος με το CRISPR.” Όπως σημείωσε η ομάδα στην εργασία της, «η τεχνολογία που ανιχνεύει και ανταποκρίνεται σε συγκεκριμένους δείκτες RNA μέσω απλών κανόνων ζευγοποίησης βάσεων RNA παρέχει μια άμεση και προγραμματιζόμενη οδό για τον έλεγχο του RNA της διαγονιδιακής μετάφρασης».

Η πλατφόρμα RADARS που αναπτύχθηκε από την ομάδα χρησιμοποιεί επεξεργασία RNA που συμβαίνει φυσικά στα κύτταρα για να παράγει την επιθυμητή πρωτεΐνη όταν ανιχνεύει ένα συγκεκριμένο RNA. «Τα ραντάρ χρησιμοποιούν απλούς κανόνες ζευγοποίησης βάσεων και επεξεργασίας RNA για να μεταφράσουν υπό όρους φορτίο mRNA παρουσία ειδών RNA στόχου», συνέχισαν οι ερευνητές.

Το σύστημα αποτελείται από ένα RNA που περιέχει δύο συστατικά: μια περιοχή οδηγού που συνδέεται με μια αλληλουχία RNA στόχο που οι επιστήμονες θέλουν να αισθανθούν στα κύτταρα και μια περιοχή φορτίου που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη ενδιαφέροντος, όπως ένα φθορίζον σήμα ή ένα κύτταρο. Οι επιστήμονές μας σχεδίασαν τα ραντάρ ώστε να περιέχουν μια περιοχή οδηγού που περιέχει μια ή περισσότερες περιοχές υβριδισμού συμπληρωματικές προς τον επιθυμητό στόχο, ένα κωδικόνιο τερματισμού εντός του πλαισίου στον οδηγό και μια κατάντη περιοχή που περιέχει την αλληλουχία πρωτεΐνης οδηγού φορτίου. αναφέρεται στο άρθρο του. Όταν το RNA-οδηγός δεσμεύεται στο RNA στόχο, δημιουργεί μια βραχεία δίκλωνη αλληλουχία RNA που περιέχει μια αναντιστοιχία μεταξύ δύο βάσεων στην αλληλουχία – αδενοσίνη (Α) και κυτοσίνη (C). Αυτή η αναντιστοιχία προσελκύει μια φυσικά απαντώμενη οικογένεια πρωτεϊνών επεξεργασίας RNA που ονομάζονται απαμινάσες αδενοσίνης που δρουν στο RNA (ADAR).

Στα ραντάρ, η αναντιστοιχία εναλλασσόμενου ρεύματος εκδηλώνεται με ένα «σήμα διακοπής» στο RNA οδηγό που εμποδίζει την παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης φορτίου. Τα ADAR επεξεργάζονται και απενεργοποιούν το σήμα διακοπής, επιτρέποντας τη μετάφραση αυτής της πρωτεΐνης. Η σειρά αυτών των μοριακών γεγονότων είναι το κλειδί για τη λειτουργικότητα του ραντάρ ως αισθητήρα. Η επιθυμητή πρωτεΐνη παράγεται μόνο αφού το οδηγό RNA συνδεθεί με το RNA στόχο και τα ADAR απενεργοποιήσουν το σήμα διακοπής.

Η ομάδα εξέτασε τα ραντάρ σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και με διαφορετικές αλληλουχίες στόχων και προϊόντα πρωτεΐνης. Διαπίστωσαν ότι τα ραντάρ έκαναν διάκριση μεταξύ των κυττάρων των νεφρών, της μήτρας και του ήπατος και μπορούσαν να παράγουν διαφορετικά σήματα φθορισμού καθώς και κασπάση, ένα ένζυμο που σκοτώνει τα κύτταρα. Τα ραντάρ μέτρησαν επίσης την έκφραση γονιδίων σε μεγάλο δυναμικό εύρος, αποδεικνύοντας τη χρησιμότητά τους ως αισθητήρες. «Εφαρμόζουμε ραντάρ σε πολλαπλά πεδία, συμπεριλαμβανομένης της παρακολούθησης μεταγραφικών καταστάσεων, του κυτταρικού θανάτου που ανιχνεύει το RNA, της αναγνώρισης κυτταρικού τύπου και του τεχνητού μεταφραστικού ελέγχου mRNA», αναφέρουν.

Τα περισσότερα συστήματα εντόπισαν επιτυχώς αλληλουχίες στόχων χρησιμοποιώντας τις εγγενείς πρωτεΐνες ADAR του κυττάρου, αλλά η ομάδα διαπίστωσε ότι η συμπλήρωση των κυττάρων με πρόσθετες πρωτεΐνες ADAR αύξησε την ισχύ του σήματος. Και τα δύο είναι δυνητικά χρήσιμα, λέει ο Obadiah. Η χρήση πρωτεϊνών επεξεργασίας εγγενών κυττάρων ελαχιστοποιεί την πιθανότητα επεξεργασίας εκτός στόχου σε θεραπευτικές εφαρμογές, αλλά η συμπλήρωσή τους μπορεί να βοηθήσει στην παραγωγή ισχυρότερων αποτελεσμάτων όταν το ραντάρ χρησιμοποιείται ως εργαλείο έρευνας στο εργαστήριο.

Οι Abudayeh, Chen και Gutenberg προτείνουν ότι επειδή το RNA-οδηγός και το RNA φορτίου είναι εναλλάξιμα, άλλοι μπορούν εύκολα να σχεδιάσουν τα ραντάρ για να στοχεύουν διαφορετικούς τύπους κυττάρων και να παράγουν διαφορετικά σήματα ή ωφέλιμα φορτία. Κατασκεύασαν επίσης πιο πολύπλοκα ραντάρ στα οποία τα κύτταρα παράγουν μια πρωτεΐνη εάν αισθανθούν δύο αλληλουχίες RNA και μια άλλη πρωτεΐνη εάν ανιχνεύσουν το ένα ή το άλλο RNA.

Η ομάδα σημείωσε ότι παρόμοια ραντάρ θα μπορούσαν να βοηθήσουν τους επιστήμονες να ανιχνεύσουν περισσότερους από έναν κυτταρικούς τύπους ταυτόχρονα, καθώς και σύνθετες καταστάσεις κυττάρων που δεν μπορούν να χαρακτηριστούν από ένα μόνο μεταγραφικό RNA. Τελικά, οι ερευνητές ελπίζουν να αναπτύξουν ένα σύνολο κανόνων σχεδιασμού για να διευκολύνουν τους επιστήμονες να αναπτύξουν ραντάρ για τα πειράματά τους. «…είμαστε ενθουσιασμένοι που βλέπουμε τι κάνει το Maidan με αυτό», σημείωσε ο Gutenberg. Άλλοι επιστήμονες θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν το ραντάρ για να χειριστούν την κατάσταση των ανοσοκυττάρων, να παρακολουθήσουν τη νευρική δραστηριότητα ως απόκριση σε ερεθίσματα ή να παραδώσουν θεραπευτικό mRNA σε συγκεκριμένους ιστούς, είπαν οι ερευνητές. “Τα πλεονεκτήματα της πλατφόρμας RADARS, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής ευαισθησίας, του επαναπρογραμματισμού, της ελάχιστης διαταραχής στις κυψέλες, της συνδυαστικής λογικής στις εισόδους και της αρθρωτής, την καθιστούν ιδανική για αμέτρητες εφαρμογές στη βασική και μεταφραστική έρευνα”, έγραψε η ομάδα. slow.” Για ωφέλιμα φορτία ραντάρ, μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλές διαφορετικές κατηγορίες πρωτεϊνικών ανιχνευτών, συμπεριλαμβανομένων των φθοριζουσών πρωτεϊνών, των φωταυγουσών πρωτεϊνών, των κασπασών, των ανασυνδυασών και των μικρών πεπτιδίων. Οι παράγοντες μεταγραφής μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μοντέλα διαφοροποίησης κυττάρων ή για να δημιουργήσουν καταρράκτες παραγόντων μεταγραφής που αποκρίνονται.

«Πιστεύουμε ότι αυτό είναι ένα πραγματικά ενδιαφέρον μοντέλο για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης», είπε ο Chen. Δεν μπορούμε καν να προβλέψουμε ποια θα είναι τα καλύτερα σχέδια. Πραγματικά προέρχεται από έναν συνδυασμό ανθρώπων με ενδιαφέρουσα βιολογία και τα εργαλεία που δημιουργείτε.

Leave a Comment