Η μελέτη διαψεύδει την υπόθεση της νικοτίνης του μηχανισμού μόλυνσης από τον SARS-CoV-2

Πρόσφατες εικασίες υποδεικνύουν ότι οι υποδοχείς νικοτινικής ακετυλοχολίνης (AChRs) μπορεί να χρησιμεύσουν ως πρόσθετοι υποδοχείς για το οξύ αναπνευστικό σύνδρομο του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) στα κύτταρα ξενιστές — επίσης γνωστό ως «νικοτινική υπόθεση».

Μελέτη: Μια πειραματική δοκιμή της υπόθεσης της νικοτίνης του COVID-19. Πίστωση εικόνας: Nhemz/Shutterstock

Μια νέα μελέτη που δημοσιεύτηκε στο PNAS Physiology επιβεβαίωσε ότι η πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2 δεν δεσμεύεται στις ορθοστερικές θέσεις της ανθρώπινης AChR και δεν ανταγωνίζεται την ACh, τη χολίνη ή τη νικοτίνη.

Ιστορικό

Η παγκόσμια πανδημία του κορωνοϊού 2019 (COVID-19), η οποία εμφανίστηκε μετά τη μόλυνση από τον SARS-CoV-2, έχει σκοτώσει περισσότερους από 6,5 εκατομμύρια ανθρώπους μέχρι σήμερα και συνεχίζει να επηρεάζει δισεκατομμύρια σε όλο τον κόσμο. Οι συνέπειες της λοιμώδους νόσου έχουν αποδειχθεί εξουθενωτικές για πολλούς – με μακροχρόνια μετα-οξέα συμπτώματα – γνωστό και ως μακροχρόνιο covid.

Παρά την εκτεταμένη έρευνα για τα συμπτώματα του COVID-19 και την παθοφυσιολογία της λοίμωξης, υπάρχει έλλειψη σαφής κατανόησης των μηχανισμών που οδηγούν στην ανάπτυξη μετα-οξέων συμπτωμάτων.

Πρόσφατα, οι επιστήμονες πρότειναν μια «υπόθεση νικοτίνης» για να εξερευνήσουν και να εξηγήσουν αυτούς τους μηχανισμούς. Εικάζεται ότι τα AChRs δρουν ως εναλλακτικός υποδοχέας, δευτερογενής στον υποδοχέα του μετατρεπτικού ενζύμου 2 (ACE2) της αγγειοτενσίνης, για τη δέσμευση της πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV-2 στα κύτταρα ξενιστές.

Επιπλέον, η δέσμευση λαμβάνει χώρα σε μια θέση που επικαλύπτει τις θέσεις δέσμευσης νευρίτη («ορθοστερική») – έτσι ώστε η θέση δέσμευσης πρωτεΐνης ακίδας να επικαλύπτεται ανταγωνιστικά με νευροτοξίνες και χολινεργικούς συνδέτες μικρού μορίου.

μελέτη

Αυτή η πειραματική μελέτη ανέλυσε την «υπόθεση νικοτίνης» της δέσμευσης του SARS-CoV-2 στα κύτταρα ξενιστές.

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε μια προσέγγιση ισορροπίας της μεθόδου ανταγωνιστικού συνδετήρα για να ελέγξει την υπόθεση της νικοτίνης. Τα AChR που εκφράζονται σε κυτταρικές επιφάνειες χρησιμοποιήθηκαν και εκφράστηκαν ετερόλογα σε κύτταρα ΗΕΚ-293.

Ο ανθρώπινος a7-AChR πλήρους μήκους που εκφράζεται σε κύτταρα ΗΕΚ-293 επωάστηκε σε συγκεκριμένη συγκέντρωση. [125I]- a-BgTx και μεταβλητές συγκεντρώσεις μη επισημασμένου ανταγωνιστή συνδέτη με σταθερή περιστροφή – για 24 ή 48 ώρες στους 37°C.

Αποτελέσματα

Σε κάθε καμπύλη, απεριόριστη συγκέντρωση [125I]Το -a-BgTx ήταν περίπου 1 nm. Όταν η συγκέντρωση του πεπτιδίου S375-L390 αυξήθηκε σε εκατοντάδες μmol, ήταν εκτός ανταγωνισμού. [125I]-a-BgTx. Επιπλέον, βρέθηκε ότι το a-BgTx ανταγωνίζεται εξίσου αποτελεσματικά [125I]-a-BgTx σε θερμοκρασία επώασης 37 °C για 24 ώρες.

Μια συγκέντρωση μη επισημασμένης τοξίνης εκτόπισε το μισό του μοσχεύματος [125I]Το -a-BgTx ήταν περίπου 2,30 nm. Ο συντελεστής Hill ήταν περίπου 1,25—πιο σημαντικός από ό,τι αναμενόταν από έναν αντίστροφο αγωνιστή. Συνήχθη το συμπέρασμα ότι η επώαση στους 37°C για 24 ώρες ήταν αρκετή για την ανίχνευση της σύνδεσης των πεπτιδίων στον ανθρώπινο υποδοχέα νικοτινικής ακετυλοχολίνης (a7-AChR). Επιπλέον, το a7-AChR συνδέεται επίσης μερικώς με το Y674-R685, αν και η δέσμευση δεν ήταν ειδική για την αλληλουχία.

Υποτίθεται ότι τρεις αργινίνες στο Y674-R685 και δύο λυσίνες στο S375-L390 θα μπορούσαν να είναι υπεύθυνες για τη μετατόπιση της ζώνης. [125I]-a-BgTx στην υψηλότερη συγκέντρωση των τεσσάρων πεπτιδίων. εν τω μεταξύ, [125I]Η σύνδεση -a-BgTx σε a7-AChR (ένα δευτερόλεπτο) ολοκληρώθηκε με χαμηλή συγκέντρωση τετραμεθυλαμμωνίου (ΤΜΑ).

Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι οι πρωτονιωμένες λυσίνες και οι αργινίνες έχουν συγγένεια με το a7-AChR και εμφανίζουν αγωνιστικά αποτελέσματα ανεξάρτητα από την πεπτιδική αλληλουχία.

Τόσο τα α-BgTx όσο και τα μικρά μοριακά προσδέματα ήταν πλήρως ανταγωνιστικά [125I]-a-BgTx, ανεξάρτητα από τη χημική ισορροπία κοντά στην περίοδο επώασης. Έτσι, η ειδική για την αλληλουχία δέσμευση πρωτεΐνης ακίδας είναι μη ανιχνεύσιμη λόγω της πολύ χαμηλής συγγένειάς της για το a7-AChR.

Η συγγένεια των Y674-R685 και S375-L390 για το a7-AChR δεν είναι ανιχνεύσιμη επειδή δεν μπορούν να ταιριάζουν επαρκώς. Ολόκληρη η περιοχή S1 (Gln-14 έως Arg-685) που περιέχει και τα δύο πεπτίδια Y674-R685 και S375-L390 δοκιμάστηκε, με παρόμοια αποτελέσματα. Ωστόσο [125I]Η δέσμευση του -a-BgTx-υποδοχέα υπερτερεί σημαντικά από την περιοχή ~1,2-μM S1.

Επιπλέον, δοκιμάστηκε μια παραλλαγή χωρίς κενά του εξωτομέα S1-S2. Μεταλλάξεις (συμπεριλαμβανομένων των R685S και R682S) εισήχθησαν στη σχισμή Y674-R685. Ούτε η Ectodomin δεν μπόρεσε να ανταπεξέλθει στον ανταγωνισμό [125I]-a-BgTx αρκετά σε συγκέντρωση 375 nm.

Ποσοτικοποιώντας το αποτέλεσμα, η συγκέντρωση του S1-S2 μεταλλαγμένου εξωτομέα κορεσμού του μισού ACE2 σε περίπου 1,7 nM. Ένας συνδέτης με τόσο ισχυρή συγγένεια για το α7-AChR εκτοπίζει περίπου το μισό του ορίου [125I]-a-BgTx σε ελάχιστη συγκέντρωση περίπου 3,4 ηΜ.

Ενώ η έκταση του αμινοξέος S375-L390 παραμένει σταθερή στον τύπο Delta (B.1.617.2) και παρουσιάζει μικρή αλλαγή στον τύπο Omicron (B.1.1.529). Και στις δύο VOCs, υπάρχει μια αλλαγή στο τέντωμα Y674-R685. Δύο VOCs παραμένουν εξαιρετικά μολυσματικές παρά τις μεταλλάξεις.

Τέλος, ο τομέας S1 δοκιμάστηκε για την επίδρασή του στην απόδοση του καναλιού. Για αυτό, χρησιμοποιήθηκε ηλεκτροφυσιολογία εμπλάστρου-σφιγκτήρα ολόκληρου κυττάρου. Η περιοχή S1 σε συγκέντρωση κοντά στα 20 ηΜ δεν μπορούσε να προκαλέσει ρεύματα από κύτταρα ΗΕΚ-293 που εκφράζουν α7-AChR. Επιπλέον, η ταυτόχρονη εφαρμογή ACh ή το λούσιμο των κυττάρων για έξι ώρες πριν από την εφαρμογή του ACh, S1 στην ίδια συγκέντρωση, δεν παρήγαγε σαφώς ρεύματα που ενεργοποιήθηκαν από 100 mM ACh.

Αποτέλεσμα

Είναι δύσκολο να αναγνωριστούν πλήρως οι μεμβρανικοί υποδοχείς στους οποίους συνδέεται ο ιός πριν προκαλέσει μόλυνση. Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη SARS-CoV-2-spike είναι απίθανο να δεσμεύεται εναλλάξ σε ορθοστερικές θέσεις των AChRs του ξενιστή — επομένως, απορρίπτοντας τη «νικοτινική υπόθεση».

Leave a Comment