Διερεύνηση της συνθετικής μηχανικής των βακτηριοφάγων

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο Πρακτικά της Εθνικής Ακαδημίας ΕπιστημώνΟι ερευνητές απέδειξαν βιολογική και συνθετική μηχανική αναστολή βακτηριοφάγου.

Μελέτη: Συνθετική μηχανική και βιολογική αναστολή βακτηριοφάγων. Πηγή εικόνας: MattLphotography/Shutterstock

Οι σοβαρές απειλές από ανθεκτικές στα φάρμακα βακτηριακές ασθένειες και οι πρόσφατες εξελίξεις στη συνθετική βιολογία έχουν τραβήξει την προσοχή σε γενετικά τροποποιημένους φάγους με θεραπευτικό δυναμικό. Μέχρι στιγμής, πολλές μελέτες για τροποποιημένους φάγους έχουν περιοριστεί στην απόδειξη της ιδέας (POC) ή στη βασική έρευνα χρησιμοποιώντας φάγους με σχετικά σύντομο γονιδίωμα ή «κιτ εμφάνισης φάγων». Επιπλέον, δεν λαμβάνονται προφυλάξεις για την εξασφάλιση αποτελεσματικής μετάφρασης για πρακτική χρήση.

Σχετικά με τη μελέτη

Η παρούσα μελέτη δημιούργησε μια πλατφόρμα για μηχανική και επαναπρογραμματισμό φάγων χωρίς κύτταρα.

Πρώτον, η ομάδα προσπάθησε να εισαγάγει εκ νέου αρκετούς φάγους άγριου τύπου (WT) που μολύνουν αρνητικά κατά Gram βακτήρια και οξύ-γρήγορα μυκοβακτήρια χρησιμοποιώντας συναρμολογημένα γονιδιώματα. Μέσα στο σφαγείο. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση πλήρως συναρμολογημένων γονιδιωμάτων φάγων που ελήφθησαν από δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) ή γονιδιώματα φάγων εκμαγείων. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να δημιουργούν ομόλογες περιοχές 28 bp έως 65 bp σε κάθε γειτονικό θραύσμα PCR. Αυτά τα θραύσματα συναρμολογήθηκαν και μεταφέρθηκαν στους βακτηριακούς ξενιστές, ενεργοποιώντας έτσι ξανά τους φάγους.

Η ομάδα ανέπτυξε θραύσματα που επέτρεψαν την τελική ένωση για την ανασύσταση φάγων από κυκλικά γονιδιώματα. Ο κολιφάγος λάμδα επανενεργοποιήθηκε αποτελεσματικά από πέντε θραύσματα σε φάγο Salmonella P22 και E. coli, μαζί με τέσσερα θραύσματα στο S. Typhimurium LT2. Επανενεργοποιήθηκε επίσης το μοντέλο μυκοφάγου D29, το οποίο μολύνει τα οξέα μυκοβακτήρια και έχει υψηλό γονιδίωμα γουανίνης-κυτοσίνης. Πέντε θραύσματα DNA δημιουργήθηκαν για τη δημιουργία του κυκλικού γονιδιώματος.

Αποτελέσματα

Το κολιφάγο μοντέλου Τ7, με γραμμικό γονιδίωμα, έδειξε γραμμική σύνθεση κατά την αντιγραφή και χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στρατηγικής της μελέτης. Το γραμμικό γονιδίωμα κατασκευάστηκε από τέσσερα θραύσματα PCR και στη συνέχεια ηλεκτροδιατρήθηκε σε Ε. coli για να ενεργοποιηθεί ο φάγος Τ7. Το κολιφάγο T3, ο φάγος Pseudomonas gh-1 και ο φάγος Salmonella SP6 είχαν προβλεφθεί ότι έχουν δομές γονιδιώματος και κύκλους ζωής παρόμοιους με τον Τ7. Η ομάδα ανακατασκεύασε επίσης με επιτυχία το T3 από θραύσματα DNA του E. coli, το SP6 από θραύσματα DNA της Salmonella Typhimurium LT2 και το gh-1 από θραύσματα DNA του Pseudomonas putida. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κατευθυντήριες γραμμές και η μεθοδολογία σχεδιασμού της μελέτης ήταν αποτελεσματικές για την εκ νέου εκτόξευση φάγων από συναρμολογημένα γραμμικά γονιδιώματα.

Ο λειτουργικός μυκοφάγος D29, ένας μη χαρακτηρισμένος μυκοφάγος Β1 και το GS4E επανενεργοποιήθηκαν από το M. smegmatis mc2 155. Το Mycophage TM4 κατασκευάστηκε από έξι χημικά δημιουργημένα τμήματα DNA με βάση τα δημόσια διαθέσιμα δεδομένα αλληλουχίας. Θραύσματα DNA ενισχύθηκαν για να δείξουν επικάλυψη 28 bp έως 38 bp με γειτονικά τμήματα, καθαρίστηκαν και στη συνέχεια κυκλοποιήθηκαν. Μέσα στο σφαγείο. Το γονιδίωμα εισήχθη στο M. smegmatis mc2 155. Το συνθετικό ΤΜ4 του οποίου το γονιδίωμα παρήχθη χημικά επανενεργοποιήθηκε. Ολόκληρο το συνθετικό γονιδίωμα του ΤΜ4 αλληλουχήθηκε με το MiSeq και αποδείχθηκε ότι ήταν 100% πανομοιότυπο με το ΤΜ4 αναφοράς, υποδεικνύοντας αποτελεσματική επανενεργοποίηση φάγου από δεδομένα αλληλουχίας.

Ο καλά χαρακτηρισμένος φάγος Τ7 επιλέχθηκε ως μοντέλο για έρευνα POC. Το μηχάνημα T7 αναγνωρίζει μια αλληλουχία σήματος συσκευασίας (Pac) για να «πακετάρει» ή να «αποθηκεύει» το γονιδίωμά του σε ένα σωματίδιο κεφαλής Τ7. Το Pac περιλαμβάνει PacB και PacC. Η μικρή υπομονάδα τερμινάσης gp18 συνδέεται με το σύμπλεγμα υπομονάδας gp19-prohead για να μεταφέρει DNA στην κεφαλή του φάγου. Μετά τη συσκευασία της κεφαλής, η ομάδα ανακάλυψε ότι το gp19 διασπά στο PacC στο γονιδίωμα του συνκατεμερούς φάγου Τ7, οδηγώντας σε ωρίμανση της κεφαλής Τ7.

Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε ένα πλασμίδιο που περιείχε Pac και “το γονίδιο που σας ενδιαφέρει” (yfg) και εγχύθηκε σε Ε. coli. Η ηλεκτροδιάτρηση του γονιδιώματος σε κύτταρα E. coli που περιέχουν το πλασμίδιο παρήγαγε συνθετικά σωματίδια μετατροπέα με βάση Τ7 (T7Pac). Στο κύτταρο, το γονιδίωμα με έλλειψη Pac παρήγαγε απογόνους ιοσωμάτια πριν συσκευάσει το πλασμίδιο που περιέχει Pac σε σωματίδια κεφαλής, παράγοντας T7Pac-yfg. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, η ομάδα συνέθεσε το T7Pac-lacZ, ένα πλασμίδιο που περιέχει lacZ. Το προϊόν λύσης συνδυάστηκε με E. coli με ανεπάρκεια lacZ και ακολούθησε επιμετάλλωση με πλάκες LB X-gal. Άρα, 1,6×104 Παρήχθησαν CFUs/ml T7Pac-lacZ και όλες οι αποικίες που σχηματίστηκαν ήταν μπλε. Στο βακτηριακό γρασίδι, το T7Pac-lacZ δεν σχημάτισε πλάκες, υποδεικνύοντας βιολογική αναστολή.

Αυτή η ομάδα κατασκεύασε το γονιδίωμα του φάγου SP6 μείον το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη καψιδίου 31. Το γονιδίωμα εισήχθη στο στέλεχος LT2 του S. Typhimurium, το οποίο εξέφραζε το γονίδιο 31. Χρησιμοποιώντας PCR, το γονίδιο 31 αφαιρέθηκε από το συνθετικό SP6.Δ Κεφάλι Επιβεβαιωμένος. Λήφθηκε υψηλός τίτλος SP6Δ Κεφάλι Το προϊόν λύσης παρήγαγε πλάκες σε ένα γονίδιο 31 που εκφράζει χλόη LT2, το οποίο απουσίαζε στο γονικό LT2.

Συνολικά, τα ευρήματα της μελέτης έδειξαν την παραγωγή φυσικών και κατασκευασμένων φάγων που μολύνουν τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια και τα οξέα μυκοβακτήρια μέσω Μέσα στο σφαγείο Συλλογή γονιδιώματος

Leave a Comment